原理

高效液相色譜儀（HPLC）是一種以液體為流動(dòng)相，采用高壓輸液系統(tǒng)，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動(dòng)相泵入裝有顆粒極細(xì)的高效固定相的色譜柱，在柱內(nèi)各成分被分離后，進(jìn)入檢測器進(jìn)行檢測的儀器。其原理為色譜法的分離原理，即溶于流動(dòng)相的各組分經(jīng)過固定相時(shí)，由于與固定相發(fā)生作用的大小、強(qiáng)弱不同，在固定相中滯留時(shí)間不同，從而先后從固定相中流出。高效液相色譜法（HPLC）是將少量液體樣品注入裝有微小顆粒（直徑為 3 ~5 um，稱為固定相）的柱子中，樣品中的單個(gè)成分隨著通過泵輸送的高壓液體（流動(dòng)相）通過色譜柱進(jìn)入裝有顆粒的柱子。柱填料用于將成分相互分離。這涉及到其分子與填料顆粒之間的各種化學(xué)和/或物理相互作用。分離出來的成分會(huì)在色譜柱出口處被檢測器檢測到，檢測器會(huì)測量這些成分的含量。檢測器的輸出稱為 "液相色譜圖"。

與低壓柱液相色譜法相比的優(yōu)勢

與傳統(tǒng)的低壓柱液相色譜法相比，高效液相色譜法（HPLC）有許多優(yōu)勢。

· 靈敏度更高（可使用各種檢測器）

· 更高的分辨率

· 速度更快

· 便于樣品回收（移除的流動(dòng)相更少）

· 多種固定相可適用

圖 2.描述色譜法的分支。

類型

HPLC 的以下變體取決于工藝中的相系統(tǒng)（固定相）。

(1)正相高效液相色譜法

又稱正相色譜法或吸收色譜法。這種方法根據(jù)極性分離分析物。它有一個(gè)極性固定相和非極性流動(dòng)相。因此，固定相通常為二氧化硅，典型的流動(dòng)相為正己烷、二氯甲烷、氯仿、二乙醚和混合物。該技術(shù)適用于對(duì)水敏感的化合物、幾何異構(gòu)體、順反異構(gòu)體、類別分離和手性化合物。

(2)反相高效液相色譜法

固定相為非極性（疏水性），流動(dòng)相為水性、中等極性。它的工作原理是疏水相互作用，因此材料的非極性越強(qiáng)，保留時(shí)間就越長。這種技術(shù)適用于非極性、極性、可電離和離子分子。

(3)體積排阻高效液相色譜法

又稱凝膠滲透色譜法或凝膠過濾色譜法。色譜柱中填充有精確控制孔徑的材料，顆粒根據(jù)分子大小被分離。較大的分子迅速通過色譜柱；較小的分子則穿過多孔填料顆粒，隨后洗脫出來。體積法還有助于確定蛋白質(zhì)和氨基酸的三級(jí)和四級(jí)結(jié)構(gòu)。它還可用于測定多糖的分子量。

(4)離子交換高效液相色譜

在這種色譜法中，保留是基于溶質(zhì)離子與固定相上的帶電位點(diǎn)之間的吸引力。帶相同電荷的離子會(huì)被排除在外。這種技術(shù)可用于純化水、蛋白質(zhì)的配體和離子交換色譜、碳水化合物和低聚糖的高 pH 陰離子交換色譜等。

(5)生物親和高效液相色譜

在這類色譜中，分離是基于蛋白質(zhì)與配體的可逆相互作用。